如何保證羅氏定量PCR儀的溫度控制的準(zhǔn)確性?
更新時(shí)間:2016-12-29瀏覽:2253次
對(duì)普通PCR儀來說,溫度控制指標(biāo)主要是指溫度的準(zhǔn)確性、均勻性、以及升降溫速度,對(duì)羅氏定量PCR儀來說,除了溫度的準(zhǔn)確性和均勻性、升降溫速度以外,還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。
溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性,它直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題,對(duì)于PCR反應(yīng)而言zui重要的莫過于溫度控制的準(zhǔn)確性,由于PCR是一個(gè)幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增的過程,擴(kuò)增過程中退火溫度的細(xì)微變化會(huì)被放大而直接影響結(jié)果,不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度,對(duì)退火溫度而言溫控顯的尤為重要,有時(shí)1度甚至0.5度的差異也能決定實(shí)驗(yàn)的成功與失敗,所謂差之毫厘,謬之千里。因而對(duì)PCR擴(kuò)增儀而言溫度控制就意味著質(zhì)量。
溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異,它關(guān)系到在不同樣品孔進(jìn)行反應(yīng)結(jié)果的一致性。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有時(shí)用同樣的樣品,同樣的PCR反應(yīng)程序,zui后的結(jié)果竟然差異非常明顯,或許就是因?yàn)椴煌恢玫臏囟炔痪恍运隆?/div>
溫度控制除了度,還有一個(gè)廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo)——升降溫的速度。更快的升降溫速度,可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間,而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間,能提高PCR反應(yīng)煌特異性。因此從本質(zhì)而言溫控方式就從以前相對(duì)穩(wěn)定耐用的機(jī)械式轉(zhuǎn)向了升降溫更快速的半導(dǎo)體。除了機(jī)械本身的原因,影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導(dǎo)熱性。
現(xiàn)在的羅氏定量PCR儀一般具有兩種溫控模式,即模塊溫控模式(Block-control)和反應(yīng)管溫控模式)(tube-control)。在模塊溫控模式下,機(jī)器根據(jù)探se器直接探se的溫控模塊(即承載樣品的金屬臺(tái))的溫度進(jìn)行控制,這種模式適用于長時(shí)間的靜態(tài)孵育(如連接、酶切、去磷酸化等)。反應(yīng)管溫控模式實(shí)際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式,根據(jù)探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出管內(nèi)/PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制。一般說來,試管溫控更為準(zhǔn)確,因?yàn)楣軆?nèi)樣品的溫度無法與溫控模塊同時(shí)達(dá)到預(yù)設(shè)溫度。特別是PCR反應(yīng)中的孵育過程一般都很短暫(30秒或更短),如果采用只有模塊溫控模式的話,反應(yīng)混合物孵育的時(shí)間與程序設(shè)定的時(shí)間會(huì)有相當(dāng)大的差距。而反應(yīng)管控制的算法能自動(dòng)補(bǔ)償時(shí)間,而且適合各種類型的反應(yīng)管,確保反應(yīng)混俁物按照程序設(shè)定的時(shí)間維持預(yù)設(shè)溫度。
有的羅氏定量PCR儀廠家推出了另一種溫控方式;熱敏電極溫控模式。該方法將一個(gè)熱敏電極插入一個(gè)專門的測量管中(管中裝有礦物油),反應(yīng)進(jìn)行時(shí),將該測量管插入溫控模塊的樣品進(jìn)行檢測。他們認(rèn)為通過此途徑可以監(jiān)測反應(yīng)管內(nèi)樣品的實(shí)際溫度,但這種方法未免有些華而不實(shí);(1)測量管中礦物油的溫度變化與實(shí)際反應(yīng)樣品的溫度變化未必一致;(2)因?yàn)闇y量管必須占用一個(gè)樣品孔,所以使用該溫控方式時(shí)就無法使用96孔PCR板作實(shí)驗(yàn)。